Как синтезируются пептиды

Пептиды – это короткие цепочки аминокислот, которые регулируют множество процессов в живых организмах, в том числе в организме человека. В этой статье мы расскажем, как происходит промышленный синтез, который позволяет получать пептиды в чистом виде, модифицировать их и производить в больших масштабах.

(На иллюстрации изображена молекулярная структура пептидного гормона окситоцина. Девять аминокислот, из которых состоит окситоцин, подписаны синим. Окситоцин в промышленности синтезируется твердофазным методом.)

Зачем синтезировать то, что и так есть в природе

В живом организме пептиды синтезируются в тканях в течение нескольких минут или даже секунд. Лабораторный синтез – длительный и дорогой процесс, требующий высокотехнологичного оборудования. Зачем тогда он нужен?

Во-первых, синтез аналогов природных пептидов позволяет лучше их изучить – определить последовательность аминокислот, из которых они состоят, и особенности взаимодействия пептидов и рецепторов.

Во-вторых, как только аминокислотная структура пептида выяснена, её можно модифицировать – заменять аминокислоты, добавлять их, изменять их пространственную конфигурацию. Это усиливает биологическое действие пептида или делает его более продолжительным. Таким образом получаются новые фармакологические препараты – например, широко известный семаглутид.

В-третьих, несмотря на временные и технологические затраты, химический синтез пептидов дешевле, чем очистка и выделение их из биологических источников. Дело в том, что природные пептиды, как правило, обнаруживаются в тканях в микроскопических количествах, а полностью очистить их от побочных продуктов затруднительно или вовсе невозможно.

Что такое синтез пептидов и какой он бывает?

Синтез пептидов – это сборка аминокислот в заданную структуру путём образования последовательных пептидных связей. Соблюдение порядка и точности синтеза важно, поскольку структура молекулы определяет её биологическую функцию.

Исторически, первые пептиды синтезировались жидкофазным методом (Liquid-phase peptide synthesis, LPPS). При таком способе все реакции происходят в растворе, и после каждого шага целевой пептид нужно выделять и очищать – кристаллизацией, осаждением или хроматографией. Жидкофазным методом были успешно получены такие известные пептиды, как окситоцин и инсулин, однако сейчас он применяется в основном для синтеза особо крупных или сложных пептидов.

В 1963 году Роберт Меррифилд описал новый, твердофазный способ синтеза (Solid-phase peptide synthesis, SPPS). Меррифилд предложил закреплять первую аминокислоту на подложке из твёрдой нерастворимой смолы и наращивать следующие аминокислоты, после каждой реакции очищая лишние реагенты и побочные продукты растворителем. Этот метод позволил автоматизировать процесс и синтезировать достаточно длинные (до 50-70 аминокислот) пептиды высокой чистоты, что дало мощный толчок к развитию пептидной химии и фармакологии. В 1984 году за методологию твердофазного синтеза Роберт Меррифилд был удостоен Нобелевской премии по химии.

Как проходит твердофазный синтез

В основе синтеза пептидов лежит последовательное соединение аминокислот: карбоксильная группа одной аминокислоты реагирует с аминогруппой соседней, образуя пептидную связь. Практическая сложность процесса заключается в том, чтобы предотвратить нежелательные реакции во время сборки, так как у каждой аминокислоты, кроме целевых, есть и другие реакционноспособные группы. Именно эту проблему на каждом шагу и решает метод твердофазного синтеза. Опишем вкратце, как он происходит.

1. Выбор аминокислот и материала-носителя. Для твердофазного синтеза требуется так называемая смола – полимерная основа. В зависимости от требуемого пептида выбирают полистирол, полиэтиленгликоль или их комбинацию. К полимерной смоле ковалентной связью “пришивается” небольшая органическая молекула, линкер, которая прикрепляет к основе первую аминокислоту.

2. Защита аминокислотных групп. У каждой аминокислоты есть аминогруппа (NH₂) и карбоксильная группа (COOH), а также боковые радикалы, которые и отличают одну аминокислоту от другой. Если их не деактивировать, они будут реагировать друг с другом случайным образом, образуя беспорядочные цепочки вместо нужной линейной последовательности. Поэтому аминокислоты для твердофазного синтеза заранее обрабатываются защитными реагентами. Наиболее часто применяются флуоренилметоксикарбонил (Fmoc) и трет-бутоксикарбонил (Boc).

Если амино- и боковые группы не активны, в реакцию вступает только свободная карбоксильная группа, которая соединяется с аминогруппой соседней аминокислоты и образует нужную пептидную связь.

3. Снятие защиты с требуемой аминогруппы. Чтобы аминогруппа могла вступить в реакцию, с неё нужно снять защитную группу. Для Boc- и Fmoc-защит способы снятия различны.

4. Активация и создание пептидной связи. Добавляется следующая аминокислота, у которой аминогруппа защищена, а карбоксильная активирована специальными реагентами. Она реагирует со свободной аминогруппой предыдущей аминокислоты.

Две последних стадии повторяются до получения пептида нужной длины. После завершения синтеза защитные группы удаляются, а молекула-линкер растворяется, и пептид отщепляется от подложки.

Любопытный факт: твердофазный синтез добавляет карбоксильные группы к свободному аминокислотному концу, то есть идёт от карбоксильной части пептида (C-конца) в направлении его аминокислотной части (N-конца). В живых организмах синтез идёт в обратном направлении: рибосома считывает матрицу мРНК и добавляет аминокислоты к карбоксильному концу.

Проблема длины: что делать, если пептид слишком длинный

Эффективность твердофазного синтеза снижается с увеличением длины пептида примерно до пятидесяти аминокислот. Однако многие пептиды гораздо длиннее – например, гормон роста соматотропин состоит из 191 аминокислоты. Для синтеза больших пептидов используется метод химической лигации (NCL), при котором фрагменты желаемой последовательности синтезируются твердофазным методом независимо друг от друга, очищаются и потом соединяются пептидной связью в водном растворе.

Таким образом из пептидных фрагментов можно получить достаточно сложные и длинные белки – инсулин или протеазу ВИЧ. То есть при помощи чисто химических методов (SPPS и NCL) возможно создать белки, которые массово получают рекомбинантным методом на биологических носителях (для инсулина – на бактериях Escherichia coli или на дрожжах). Однако промышленный синтез инсулина твердофазным методом экономически нецелесообразен.

Постсинтетическая модификация пептидов

Ещё одно преимущество лабораторного синтеза пептидов – возможность изменить их свойства уже после сборки аминокислотной цепи. Для этого используется циклизация пептидов или добавление химических модификаторов: полиэтиленгликоля, жирных кислот или ферментов. Они решают разные задачи: повышают стабильность пептида в организме, усиливают связываемость с рецепторами и проникаемость пептида в клетки.

Постсинтетическая модификация – один из способов решения ключевых проблем многих пептидных препаратов: сложности доставки вещества к месту назначения, быстрого распада и низкой биодоступности.

Очистка и контроль: что происходит до того, как пептид попадает во флаконы

После твердофазного синтеза пептид не сразу становится готовым продуктом. Сначала его очищают от примесей и побочных продуктов методом жидкостной хроматографии. Затем необходимо убедиться, что получен именно желаемый пептид и что он имеет требуемую чистоту. Для этого определяется качественный и количественный состав смеси (сколько и каких веществ в ней содержится), а также подтверждается масса молекулы и её аминокислотный состав.

Это особенно важно, если пептиды производятся для иммуноферментных систем диагностики (ИФА, ELISA), где требуется высочайшая чистота антигенов.

Как ещё можно синтезировать пептиды?

Химический синтез – не единственный способ получения пептидов. В исследованиях и производстве используются разнообразные биотехнологические подходы, самый известный из которых – рекомбинантный метод. Ген, кодирующий нужный пептид, доставляется в клетку-хозяина (бактерии, дрожжи или клетку животного) при помощи экспрессионного вектора, специальной генетической конструкции на основе плазмиды или вируса. После доставки в клетке запускается экспрессия, то есть синтез закодированного в гене белка.

Рекомбинантным методом производятся крупные пептиды и белки – инсулин, интерфероны, гормон роста. Однако для небольших пептидов, в несколько аминокислот, метод работает плохо. Кроме того, он не годится для нестандартных аминокислот и для производства пептидов, токсичных для клеток-хозяев.

Альтернативная технология – бесклеточная экспрессия белков. Здесь используется заранее подготовленный клеточный экстракт (лизаты кишечной палочки или зародышей пшеницы), который содержит механизмы для синтеза белка и в который добавляют химические компоненты, необходимые для запуска и поддержания реакции: аминокислоты, источники энергии для работы рибосом, а также ДНК или мРНК целевого белка.

Таким способом получаются белки, которые невозможно синтезировать в живых клетках, например, токсичные или нестабильные. Однако бесклеточный метод дорог и в настоящее время не позволяет производить белки в промышленном масштабе.

В целом граница между химическими и биологическими методами синтеза размыта. В современном фармацевтическом производстве SPPS применяется для сравнительно коротких пептидов (примерно до 50 аминокислот), рекомбинантная экспрессия – для более крупных, а бесклеточная экспрессия – для синтеза малых объёмов в исследовательских целях. Используются также гибридные химико-биологические стратегии.

Нужно ли знать, как именно был синтезирован пептид?

Да. Качество синтеза пептида определяет его чистоту и фактическую идентичность (то есть, является ли пептид той молекулой, за которую себя выдаёт), а потому имеет прямые клинические последствия. Инсулин или гормон роста, синтезированный с фармацевтическим качеством, обладает заданным процентом примесей, заданной эффективностью и стабильностью от партии к партии. Та же самая аминокислотная последовательность, полученная на нерегулируемом производстве, не гарантирует стабильных свойств.

Известные случаи побочных эффектов и нежелательных явлений при приёме пептидов, как правило, связаны с продукцией, произведённой вне промышленных стандартов. Поэтому то, в каких условиях и каким образом был получен продукт, имеет важное значение для всех, кто использует или оценивает пептидные препараты.

Будущее пептидного синтеза: вызовы и проблемы ближайших лет

В последние годы производство пептидов резко увеличилось, в том числе из-за повышенного интереса к препаратам-агонистам GLP-1 (на основе семаглутида и тирзепатида). Поэтому индустрия ищет способы снизить расход реагентов и стоимость синтеза. Кроме того, возрастает нагрузка на окружающую среду, так как крупномасштабный твердофазный синтез производит значительное количество отходов растворителей, в частности, диметилформамида при использовании Fmoc. Вероятно, в будущем для синтеза будут применяться менее токсичные и более экономичные ингредиенты.

Ещё одна новая тенденция – использование вычислительных методов и искусственного интеллекта для анализа и проектирования пептидов. Такая комбинация даёт возможность быстро проверять идеи и проводить множество экспериментов одновременно. Например, при помощи глубокого обучения были созданы модели тысяч потенциальных антимикробных пептидов, которые потом синтезировались в лаборатории бесклеточным методом и проверялись экспериментально.

За сто с лишним лет синтез пептидов прошёл путь от единичных лабораторных экспериментов до массового автоматизированного производства. В ближайшем будущем можно ожидать дальнейшее развитие синтеза в сторону эффективности и экономичности, а также получения ещё более сложных молекул, обладающих заранее заданными свойствами.

Источники: